ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി: നിറച്ചാർത്തിലൂടെ ഒരു സത്യാന്വേഷണം

ഡോ. രഞ്ജിത്ത് എസ്.

Scientist, SCTIMST പൂജപ്പുര

ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി എന്നത് ഇന്ന് ഏതൊരു ആധുനിക വിശകലന ശാലയിലും അനുപേക്ഷണീയമായ ഒരു ഉപകരണമാണ്. പല തരത്തിലുള്ള സാങ്കേതിക വിദ്യകൾ ഇണക്കി ചേർത്തിട്ടുള്ള, പല ധർമ്മങ്ങൾ നിർവഹിക്കുന്ന ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി ഉപകരണങ്ങൾ ഇന്നുണ്ട്. ആ മേഖലയിലേക്ക് ഒരെത്തിനോട്ടമാണ് ഈ ലേഖനം.

മിഖായേൽ ത്സ്‌വ്യത് (Mikhail Tsvet )

ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി എന്ന വാക്ക് പിറവിയെടുത്തത് നിറം എന്നർത്ഥം വരുന്ന ക്രോമ, എഴുതുക എന്നർത്ഥമുള്ള ഗ്രാഫെയ്ൻ എന്നീ പദങ്ങളുടെ സംയോഗഫലമായാണ്. ഈ ശാസ്ത്ര വിശകലന രീതിയ്ക്ക് പേര് കിട്ടിയതിനു പിന്നിലൊരു കഥയുണ്ട്. ക്രോമാറ്റോഗ്രഫിയുടെ പ്രാഗ്രൂപങ്ങൾ മുന്നേ തന്നെ നിലവിൽ ഉണ്ടായിരുന്നെങ്കിലും 19-ആം നൂറ്റാണ്ടിന്റെ അവസാനത്തോടടുപ്പിച്ച് ആണ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി എന്ന പേരും വിശകലനസമ്പ്രദായവും നിലവിൽ വന്നത്. മിഖായേൽ ത്സ്‌വ്യത് എന്ന റഷ്യൻ സസ്യശാസ്ത്രജ്ഞൻ ആയിരുന്നു ഇതിനു പിന്നിൽ. സസ്യങ്ങളുടെ വിവിധ ഭാഗങ്ങൾക് നിറം നൽകുന്ന വർണകങ്ങളായിരുന്നു ത്സ്‌വ്യതിന്റെ ഇഷ്ടപഠന  വിഷയം. ഒരിക്കൽ അദ്ദേഹം തന്റെ പരീക്ഷണശാലയിൽ സസ്യഭാഗങ്ങൾ ചതച്ചെടുത്ത നീരിൽ പരീക്ഷണം നടത്തികൊണ്ടിരിക്കുകയായിരുന്നു.  ആകസ്മികമായി കാൽസ്യം കാർബണേറ്റ് നിറച്ച ഗ്ലാസ് ട്യൂബിലേക്ക് അല്പം നീര് തെറിച്ചു വീഴുകയുണ്ടായി. കുറച്ചു കഴിഞ്ഞ്  പരീക്ഷണം പൂർത്തിയാക്കി  ചുറ്റും നോക്കിയ ത്സ്‌വ്യത് കണ്ടത് തൂവെള്ളനിറമായിരുന്ന ഗ്ലാസ് ട്യൂബിൽ അവിടവിടായി നിറങ്ങളുടെ ബാൻഡുകൾ രൂപപ്പെട്ടിരിക്കുന്നതാണ്. ഈ ദൃശ്യത്തിൽ ആകൃഷ്ടനായ അദ്ദേഹം വീണ്ടും വീണ്ടും ആവർത്തിച്ച് ഈ പ്രതിഭാസം ഉറപ്പു വരുത്തി. നിറങ്ങൾ കൊണ്ടുള്ള എഴുത്ത് എന്നർത്ഥം വരുന്ന ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി എന്ന് ഈ രീതിയ്ക്ക് പേര് നൽകുകയും ചെയ്തു. എന്നാൽ റഷ്യൻ ഭാഷയിൽ ത്സ്‌വ്യത് എന്ന പദത്തിന് നിറം എന്നാണ് അർത്ഥമെന്നും അങ്ങനെ സാർ ചക്രവർത്തിയുടെ ഉരുക്കുമുഷ്ടിയിലമർന്ന റഷ്യയിൽ ഒരു സാധാരണക്കാരനായ തന്റെ നാമം അനശ്വരമാകാൻ വേണ്ടിയാണു ത്സ്‌വ്യത് ആ പേര് നൽകിയതെന്നും വാദങ്ങൾ നിലവിലുണ്ട്. എന്ത് തന്നെയായാലും ഒരുപാട് മേഖലകളിൽ ഉപയോഗപ്രദമായ ഒരു കണ്ടുപിടിത്തം തന്നെയായിരുന്നു സ്വെറ്റ് നടത്തിയതെന്ന് നമുക്ക് നിസംശയം പറയാം. ആദ്യകാലത്തു അധികം ആരെയും ആകർഷിച്ചിലെങ്കിലും പിന്നെ ഒഴിച്ചുകൂടാൻ വയ്യാത്ത ഒരു വിശകലന സംവിധാനമായി ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി മാറി. മിശ്രിതങ്ങളിലെ ഘടക പദാർത്ഥങ്ങളെ കണ്ടെത്താനും, വേർതിരിക്കാനും, അവയുടെ ഗാഢത കൃത്യമായി അളന്നെടുക്കാനും എല്ലാം ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി നമ്മെ സഹായിക്കുന്നു.

ക്രൊമാറ്റോഗ്രാഫി: സ്ഥിരദശയും (stationary phase), ചലനദശയും (mobile phase)

അധിശോഷണം(അഡ്സോർപ്ഷൻ),  പങ്കു വെയ്ക്കൽ (പാർട്ടീഷൻ) തുടങ്ങിയ പ്രതല പ്രതിഭാസങ്ങളാണ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫിയുടെ പൊതുവായ പ്രവർത്തന തത്വങ്ങൾ. അഡ്സോർപ്ഷൻ എന്ന പ്രതല പ്രതിഭാസത്തിൽ അഡ്സോർബന്റ് എന്ന സ്ഥിര ഘടകത്തിന്റെ പ്രതലത്തിൽ അഡ്സോർബേറ്റ് എന്ന ലഘുഘടകത്തിന്റെ കൂടിച്ചേരലാണ് നടക്കുന്നത്. ഇതിനു സമാനമായി ഏതൊരു ക്രോമാറ്റോഗ്രഫിയിലും സ്ഥിരദശ (stationary phase), ചലനദശ (mobile phase) എന്നിങ്ങനെ രണ്ടു ഘടകങ്ങൾ ഉണ്ടാകും. സ്ഥിരദശ എന്നത് പ്രധാനമായും ഖര/ദ്രാവകാവസ്ഥയിൽ ഉള്ള കൃത്യമായ പ്രതല സ്വഭാവം ഉള്ള ഒരു വസ്തുവായിരിക്കും. എന്നാൽ ചലനദശ ദ്രാവക/വാതകാവസ്ഥയിൽ ആയിരിക്കും. മിശ്രിതത്തിലെ ഘടക പദാർത്ഥങ്ങൾക്ക് സ്ഥിര, ചലന ദശകളുമായുള്ള പാരസ്പര്യത്തിലെ വ്യത്യാസം ആണ് അവയുടെ വേർതിരിക്കലിന് സഹായകമാകുന്നത്. ചലനദശ സ്ഥിരദശയുമായി സമ്പർക്കത്തിൽ മുന്നോട്ട് നീങ്ങുമ്പോൾ ചലനദശയുമായി കൂടുതൽ പൊരുത്തമുള്ള ഘടകപദാർത്ഥങ്ങൾ വളരെ വേഗത്തിൽ മുന്നോട്ട് നീങ്ങുന്നു. അതേസമയം സ്ഥിരദശയുമായാണ് ആകർഷണം കൂടുതലെങ്കിൽ ആ ഘടകങ്ങൾ വളരെ സാവധാനം മാത്രമേ മുന്നോട്ട് നീങ്ങുകയുള്ളൂ. ഇത്തരത്തിൽ ചലനദശയോടൊപ്പം മുന്നോട്ട് നീങ്ങി സ്ഥിരദശ കടന്നു പോകാൻ ഓരോ പദാർത്ഥങ്ങളും എടുക്കുന്ന സമയത്തെ അവയുടെ റീടെൻഷൻ ടൈം (RT) എന്നാണ് വിളിക്കുന്നത്. RTയിലുള്ള വ്യത്യാസം വച്ചാണ് ഓരോ പദാർത്ഥങ്ങളെയും തിരിച്ചറിയുന്നത്. സാധാരണ ലാബുകളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന തിൻ ലെയര്‍ ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി (TLC), പേപ്പർ ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി തുടങ്ങി വളരെ ഉന്നതശ്രേണിയിൽ ഉള്ള ഹൈ പെർഫോമൻസ്‍ ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി(HPLC), ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി മാസ്സ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (LCMS), ഗ്യാസ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി (GC) തുടങ്ങിയവയിലെല്ലാം പദാർത്ഥങ്ങളെ വേർതിരിക്കുന്നത് ഇതേ തത്വത്തിന്റെ അടിസ്ഥാനത്തിലാണ്.

ക്രോമാറ്റോഗ്രഫിയുടെ ഉപയോഗം ഏകദേശം എല്ലാ വിഷയങ്ങളിലേയ്ക്കും വ്യാപിച്ചു കിടക്കുന്ന ഒന്നാണ്. കെമിസ്ട്രി, ബയോളജി, പരിസ്ഥിതി പഠനം, ഭൂമിശാസ്ത്രം, മരുന്നു നിർമാണം, ഫോറൻസിക് സയൻസ് തുടങ്ങി എല്ലാ മേഖലയിലും ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി ഉപയോഗ പ്രദമാണ്. വസ്തുക്കളുടെ ശുദ്ധത മനസിലാക്കുന്നതിനും, അശുദ്ധ/വിഷ പദാർഥങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം മനസിലാക്കാനും അളക്കാനും ഒക്കെ ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി നമ്മെ സഹായിക്കുന്നു. ദ്രാവക ലായകങ്ങളിൽ ലയിച്ചു കാണുന്ന പദാർത്ഥങ്ങളെ കണ്ടെത്താനായി ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ എളുപ്പത്തിൽ ബാഷ്പീകരിക്കപ്പെടുന്ന (volatile) പദാർത്ഥങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലിനും അളവു നിർണ്ണയത്തിനും ഗ്യാസ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി ഉപയോഗപ്പെടുത്താം.

കോളം ക്രൊമറ്റോഗ്രഫി – Photographic sequence കടപ്പാട് വിക്കിപീഡിയ

രസതന്ത്ര ലാബുകളിൽ കാർബണിക സംയുക്തങ്ങളുടെ ശുദ്ധീകരണത്തിനു സ്ഥിരമായി ഉപയോഗിക്കുന്ന കോളം ക്രോമാറ്റോഗ്രഫിയും  അതിന്റെ ലഘുരൂപമായ TLC യുമാണ് ഏറ്റവും കൂടുതലായും സാധാരണമായും ഉപയോഗിക്കപ്പെടുന്ന ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി രീതികൾ. ഒരു രാസപ്രവർത്തനം പൂർണമായി നടന്നോ അഭികാരകങ്ങളോ രാസത്വരകങ്ങളോ ബാക്കി കിടക്കുന്നുണ്ടോ എന്നൊക്കെ അറിയാനും ഒന്നിൽ കൂടുതൽ ഉത്പന്നങ്ങൾ ഉണ്ടായിട്ടുണ്ടെങ്കിൽ അവയെ വേർതിരിക്കാനും ശുദ്ധീകരിക്കാനും ഈ രീതികൾ അവലംബിക്കാവുന്നതാണ്. സിലിക്ക (SiO2), അലുമിന (Al2O3) തുടങ്ങിയ അഡ്സോർബന്റുകൾ ആണ്  ഇവിടെ സ്ഥിരദശകളായി ഉപയോഗിക്കുന്നത്. മിശ്രിതത്തിലെ ഘടകപദാർത്ഥങ്ങളെ ലയിപ്പിക്കാൻ ശേഷിയുള്ള ലായകങ്ങളെയാണ് ചലനദശകളായുപയോഗിക്കുന്നത്. ഇവയെ പൊതുവെ എലുവന്റുകൾ (Eluents) എന്നാണറിയപ്പെടുന്നത്.

HPLCയുടെ വിവിധ ഭാഗങ്ങൾ

HPLC പോലുള്ള ഉന്നത ശ്രേണിയിലുള്ള ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി രീതികളിൽ സിലിക്ക തരികളോ കാർബൺ ചെയിനുകൾ കൊണ്ട് പൊളാരിറ്റി വ്യത്യാസപ്പെടുത്തിയ സിലിക്ക കണികകളോ നിറച്ച സ്റ്റീൽ കോളങ്ങൾ ആണ് സ്ഥിര ദശകൾ ആയി ഉപയോഗിക്കുന്നത്. കൃത്യതയുള്ള ഇലക്ട്രോണിക് ഡിറ്റക്ടറുകളുടെ സഹായത്താൽ മിശ്രിതങ്ങളിലെ ഘടകപദാർത്ഥങ്ങളെ വേർതിരിച്ചറിയാനും കൃത്യമായി അളന്നെടുക്കാനും HPLC ഉപയോഗപ്പെടുത്താം. കാർബണിക സംയുക്തങ്ങൾ, അമിനോ ആസിഡുകൾ, ഷുഗറുകൾ തുടങ്ങിയവയൊക്കെ വിശകലനം ചെയ്യാൻ HPLC ഉപയോഗിക്കാം. ഘടകങ്ങളെ സ്ഥിര / ചലന ദശകളുമായുള്ള ആകർഷണത്തിനു പകരമായി ഒരു അരിപ്പുകൊണ്ടെന്ന പോലെ അവയുടെ വലിപ്പത്തിനുസരിച്ചാണ് വേർതിരിക്കുന്നതെങ്കിൽ അത്തരം ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫിയെ സൈസ് എക്സ്ക്ലൂഷൻ കോമാറ്റോഗ്രാഫി (Size Exclusion Chromatography, SEC) എന്നാണ് പറയുന്നത്. പോളിമറുകളുടെ വിശകലനത്തിനും ശുദ്ധീകരണത്തിനും അവയുടെ  തന്മാത്രാഭാരം (മോളികുലാർ മാസ്) കണ്ടെത്താനുമാണ് SEC പ്രധാനമായി ഉപയോഗിക്കുന്നത്‌.  അതുപോലെ വാതകവസ്ഥയിലുള്ള ഘടക പദാർത്ഥങ്ങളുടെ വിശകലനത്തിനാണ് GC ഉപയോഗിക്കുന്നത്. എളുപ്പത്തിൽ ബാഷ്പമാകുന്ന കാർബണിക ലായകങ്ങൾ, സംയുക്തങ്ങൾ, വിഷവാതകങ്ങൾ, എന്നിവയുടെ വിശകലനം  GC യിലൂടെ സാധ്യമാണ്. വായു മലിനീകരണം തിട്ടപ്പെടുത്തുന്നതിനും രാസനിർമ്മാണശാലകളിലെ വായുവിന്റെ ഗുണമേന്മ നിർണ്ണയിക്കാനും ഈ സംവിധാനം ഉപയോഗിക്കാവുന്നതാണ്. പ്രത്യേകം തയ്യാറാക്കിയ ക്യാപ്പിലറി കോളങ്ങൾ ആണ് GCയിൽ സ്ഥിരദശയായി ഉപയോഗിക്കുന്നത്.  നിഷ്ക്രിയ വാതകങ്ങളായ ആർഗോൺ, ഹീലിയം, നൈട്രജൻ മുതലായവയായിരിക്കും ചലനദശ. അവയെ പൊതുവെ സംവഹന വാതകങ്ങൾ എന്നാണ് വിളിക്കുന്നത്. സ്ഫോടകവസ്തുക്കൾ, കീടനാശിനികൾ, തുടങ്ങിയവയുടെ സാന്നിദ്ധ്യം കണ്ടു പിടിക്കാനും GC ഉപയോഗിക്കുന്നുണ്ട്.

 

ഗ്യാസ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി

ആരോഗ്യരംഗത്തും വളരെയധികം ഉപകാരപ്രദമാണ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി വിശകലന രീതികൾ. രോഗനിർണയത്തിന് സഹായകമാകുന്ന ചില തന്മാത്രകളുടെ സാന്നിദ്ധ്യമോ അസാന്നിദ്ധ്യമോ ഇത്തരത്തിൽ കണ്ടെത്താവുന്നതാണ്. രോഗത്തിന്റെ പ്രകടമായ ലക്ഷണങ്ങൾ പുറത്തു വരുന്നതിനു മുന്നേ തന്നെ ഭാവിയിൽ രോഗമുണ്ടാകാൻ ഉള്ള സാധ്യത ചില രാസ തന്മാത്രകളുടെ സാന്നിധ്യം കൊണ്ട് മനസിലാക്കാം. അവയെ ബയോ മാർക്കറുകൾ എന്നാണ് പറയുക.  അർബുദം പോലെയുള്ള മാരക രോഗങ്ങളുടെ ബയോമാർക്കറുകളുടെ സാന്നിധ്യം ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി വഴി കണ്ടെത്താനാകും. മാറിട, ഗർഭാശയഗള, ശ്വാസകോശാർബുദങ്ങൾ പോലുള്ള മാരകരോഗങ്ങളുടെ മാർക്കറുകളുടെ സാന്നിദ്ധ്യം ശരീരദ്രവങ്ങളുടെ ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി വിശകലനത്തിലൂടെ കണ്ടെത്താവുന്നതാണ്. അത് പോലെ നിശ്വാസവായുവിന്റെ വിശകലനം വഴി വാതകാവസ്ഥയിലുള്ള ചില ബയോ മാർക്കർ തന്മാത്രകളുടെ സാന്നിധ്യം കണ്ടെത്താനും അതുവഴി മുൻകൂട്ടി രോഗനിർണയം നടത്താനും GC വഴി കഴിയുന്നതാണ്. മെഡിക്കൽ ഉപകരണങ്ങളുടെ നിലവാരം തിട്ടപ്പെടുത്തുന്നതിനും ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി വഹിക്കുന്ന പങ്ക് ചില്ലറയല്ല. ഉപകരണങ്ങളിൽ നിന്നും രോഗിയ്ക് ദോഷകരമായ രാസവസ്തുക്കൾ ഒന്നും ഊറി വരുന്നില്ല എന്ന് ഉറപ്പു വരുത്തുന്നത് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി വിശകലനം വഴിയാണ്. മരുന്നുകളുടെ പരീക്ഷണ ഘട്ടത്തിലെ കാലക്രമേണയുള്ള ഗാഢതാ വ്യത്യാസവും ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി മുഖേനയാണ് പഠിക്കുന്നത്. അതുപോലെ തന്നെ കാലപഴക്കം അനുസരിച്ച് ഉപകരണത്തിന്റെ നാശനം പഠിക്കുന്നതിനും ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി ഉപയോഗിക്കാം. മെഡിക്കൽ ഉപകരണങ്ങൾ അണുവിമുക്തമാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന എത്തിലീൻ ഓക്‌സൈഡ് പോലുള്ള മാരക രാസവസ്തുക്കളുടെ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ബാക്കി ഇല്ലായെന്ന് ഉറപ്പു വരുത്താൻ GC ആണുപയോഗിക്കുന്നത്.

വളരെയധികം കണിശത ഉള്ള മാസ്സ് ഡിറ്റക്ടറുകളുടെ ഉപയോഗം പൈകോ (10 ^-12 ) മുതൽ ഫെംറ്റോ ഗ്രാം (10^-15) വരെയുള്ള വളരെ താഴ്ന്ന അളവിലുള്ള പദാർഥങ്ങളുടെ വിശകലനത്തിന് സഹായകമാകുന്നു. ദുരൂഹ സാഹചര്യത്തിൽ മരണമടഞ്ഞ ആളിന്റെ ശരീരദ്രവങ്ങളിൽ നിന്ന് വളരെ കുറഞ്ഞ അളവിൽ പോലും വിഷപദാർത്ഥത്തിന്റെ സാന്നിധ്യം മനസിലാക്കാൻ ഈ രീതി അവലംബിക്കാവുന്നതാണ് (LCMS- Liquid chromatography–mass spectrometry). ഭക്ഷണപദാർത്ഥങ്ങൾ, പച്ചക്കറികൾ, തുടങ്ങിയവയിലെ കീടനാശിനികളുടെ സാന്നിധ്യവും ഇത്തരത്തിൽ കണ്ടുപിടിക്കാവുന്നതാണ്. ഇപ്രകാരം അനന്തമായ സാധ്യതകളുള്ള ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി സാങ്കേതികവിദ്യ ശാസ്ത്രത്തിന്റെ മുന്നോട്ടുള്ള യാത്രയ്ക്ക് ഒരു മുതൽ കൂട്ടാണെന്നത് തർക്കമില്ലാത്ത കാര്യമാണ്.

Leave a Reply